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    公开号:WO1989012096A1
    申请号:PCT/JP1989/000521
    申请日:1989-05-25
    公开日:1989-12-14
    发明作者:Toshii Iida；Yuka Fuse；Masahiro Tajima；Mitsuo Yanagi；Hiroshi Okamoto
    申请人:Shiseido Co. Ltd.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 c未端ァ ミ ド化酵素組成物、 調製方法および使用
    [0002] 〔技術分野〕
    [0003] 本発明は、 血清または血漿由来の C末端ァ ミ ド化酵素組成 物およびその調製方法ならびにそれらを使用する c末端がァ. ミ ド化されたぺプチ ドまたはその誘導体の製造方法に関する 細
    [0004] 〔背景技術〕
    [0005] c末端がア ミ ド化されて初めて生理活性を示すペプチ ド、 例えばカルシ ト ニン、 ガス ト リ ン、 セク レチン血管作用性小 腸ペプチ ド （ V I P ) 、 成長ホルモ ン放出因子、 副腎皮質剌 激ホルモ ン放出因子等は、 生体内で酵素反応によりグリ シン 付加体から生成されるこ とが知られている。 これらの生理活 性ペプチ ドの多く は、 医薬品として有用であり、 現在、 カル シ ト ニン、 セク レチンなどは医薬品として市販されている。
    [0006] これらのペプチ ドの入手は、 従来主と して生体からの分離 精製によって行われており、 工程が煩雑でまた、 起源の生体 も入手しに く い。 従って、 現在市販の上記ペプチ ドは非常に 高価なものとなっている。
    [0007] そこで、 近年、 組換え D N A技術を用いて、 これらの生理 活性べプチ ドを生産しょう とする試みが行われている。 しか しながら、 大腸菌、 酵母、 枯草菌などを宿主と した組換え D N A技術では、 生産したペプチ ドの C末端ァ ミ ド化ができ ず、 上記ぺプチ ドの生産をおこなう上での障害となっている： そこで、 生体外での C末端ァ ミ ド化を容易に、 しかも、 安価 におこなえる技術が望まれている。
    [0008] 一方、 前述の生体内酵素反応、 すなわちペプチ ド類 c未端 グリ シン付加体の c末端ア ミ ド化に関与する酵素は、 ぺプチ ジルグリ シン一 α—ア ミデーティ ングモノ ォキシゲナーゼ ( C末端ア ミ ド化酵素）（EC.1.14.17.3) と呼ばれており
    [0009] (Bradbur ら、 ature, 298 , 686, 1982:Glembotsl iら、 J. Biol. Chem. ,259 ,6385,1984) 、 次のような反応を触媒して いると考えられている。
    [0010] -CHC0NHCHzC00H→ -CHC0NH2+グリ ォキシゾレ酸 生体内でのァ ミ ド化機構の解明、 ならびに組換え D N A技 術によって生産されるペプチ ドの生体外における C末端ア ミ ド化を目的に、 本酵素を精製する試みがなされている。 今ま でに比活性を出発原料に比し 100倍以上に高めた精製例とし ては、 ゥシ脳下垂体中葉 （Murthyら、 J. Bio 1. Chem. , 261 , 1815, 1986) 、 ブタ脳下垂体（Kizerら、 Endocrinology.118 ： 2262, 1986： Bradburyら、 Eur. J. Biochem. , 169 , 579, 1987) - ブタ心房 （Kojimaら、 J. Biochem., 105 , 440, 1989) , ァフリ 力、ンメ 力"ェ クレ体皮 (Mizun— 0ら、 Biochem. Biophys. Res. Commun, 137 , 984, 1986) . ラ ッ ト甲状腺腫瘍（Mehtaら、 Arch. Biochem: Biophys. , 261 ,44, 1988) 由来のものが報告されている。 し かし、 KiZerらの方法を除いては精製が 5 〜 6 ステ ツプに渡 つており操作が煩雑である。 また Kizerらの方法でもセ フ ァ デッ クス G-100(フアルマシァ社製） ゲル濾過の工程があ り 、 溶出に時間がかかると同時に大量処理が困難である。
    [0011] 血液中の C末端ア ミ ド化酵素の存在については、 また、 ラ 卜 （Eipperら、 Endocrinology, 116 ,2497, 1985) 及びヒ 卜 (Wandら、 Metabolism, 34.1044, 1985) の報告があるが共に 比活性は低く、 精製の試みもなされていない。
    [0012] 以上のように、 C末端ア ミ ド化酵素の簡便かつ大量処理が 可能な精製法は確立されていない。 また、 血清及び血漿から は全く精製が行われたことはな く 、 ならびに C末端ァ ミ ド化 酵素活性物質を生体外で使用する前記 C末端がァ ミ ド化され たペプチ ド類またはその誘導体を効率よ く 、 安価かつ大量に 製造する方法は現在知られていない。
    [0013] 〔究明の開示〕
    [0014] 前述のように、 C未端ア ミ ド化酵素は、 生体内で非常に興 味深い作用を示し、 特定の生体器官に由来する一定の純度を 有する組成物も知られている。 しかしながら、 これらの酵素 組成物を生体外での実用的な反応に使用するには、 その起源 の入手困難性もあり、 必ずしも満足できるものとはいえない そこで、 本発明者らは、 かかる酵素反応に使用し得る酵素組 成物を見い出すべく研究を重ねた結果、 驚く べき こ とに、 比 較的安価にしかも大量に入手し得る、 特にゥマおよびブタの 血惰または血漿が高い前記ア ミ ド化酵素活性を有し、 さ らに かかる血清もし く は血漿、 またはこ れらに由来する酵素組成 物が生体外で前記酵素反応を促進し得る能力を有する こ と を 見い出し本発明を完成した。 .
    [0015] 従って、 本発明は、 ペプチ ドもしく はタ ンパク質またはそ れらの誘導体の C末端ダリ シン付加体の生体外における C末 端ァ ミ ド化反応を促進する血清または血漦由来の酵素組成物 およびその調製方法ならびに該組成物の使用方法を開示する,
    [0016] 〔図面の簡単な説明〕
    [0017] 第 1図は、 へパリ ンセファ ロース CL一 6Bカ ラムク ロマ トグ ラフィ一の溶出パターンを示すグラフであり、
    [0018] 第 2図は、 Phe-Gly-Phe-Gly を基質として、 実施例 2に従 つてゥマ血清から調製した酵素試料を①は 1 0 W、 ②は 5 0 使用して反応を行い、 HPLCで分圻した時の 214nmの吸収を 示すグラフである。
    [0019] 〔詳細な記逮〕
    [0020] 酵素組成物
    [0021] より具体的には、 本発明によれば、 次式
    [0022] ( H )
    [0023] X - N - A -CONHCHzCOOH ( I ) (上式中、 Aは、 天然の α—ア ミノ酸に由来する α—ァ ミノ 基もし く はィ ミノ基および —力ルボキシル基以外の残基を 表しており、 Xは、 水素原子またはカルボ二ル基を介して Ν 原子と結合するア ミ ノ酸誘導体の残基を表す） で示される C 末端グリ シン付加体に作用して、 次式 ( H )
    [0024] !
    [0025] X - N - A - C0NH 2 ( Π )
    [0026] (上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示される C 末端ァ ミ ド化物とグリ ォキ シル酸との生成反応に関与し、 か つ、 該反応に実質的に悪影響を及ぼさない純度を有する血请 または血漿由来の C末端ア ミ ド化酵素組成物が提供される。 なお、 式 （ I ) および （ Π ) のカ ツ コ内の水素原子 （ H ) は、 Aが or —イ ミ ノ基を有する or —ア ミ ノ酸に由来する場合 には水素原子を有しないこ とを意味する。
    [0027] 本発明の式 （ I ) で示される C末端グリ シ ン付加体、 すな わち本発明の酵素組成物の基質と しては、 一般的に、 前記式 ( H )
    [0028] の X— N— A— C O —部が天然または合成のァ ミ ノ酸誘導体 類、 特に、 ペプチ ドまたは蛋白質類に由来し、 その C末端ァ ミ ノ酸残基 〔一 N ( H ) 一 A— C 0—で示される〕 にグリ シ ンがぺプチ ド結合した化合物が挙げられる。 C末端ァ ミ ノ 酸 残基と しては天然の —ア ミ ノ酸、 特にタ ンパク質構成ア ミ ノ酸、 例えばグ リ シ ン、 ァ ラ ニ ンのよ う な脂肪族ァ ミ ノ酸 ； ノ リ ン、 ロ イ シ ン、 イ ソ ロ イ シ ンのよ う な分枝ア ミ ノ 酸 ； セ リ ン、 ス レオニ ンのよ う な ヒ ド ロ キ シア ミ ノ 酸 ； ァス ノ、 'ラ ギ ン酸、 グルタ ミ ン酸のよう な酸性ア ミ ノ酸 ； ァスパラギン、 グルタ ミ ンのよ う なア ミ ド ； リ ジ ン、 ヒ ド ロ キ シ リ ジ ン、 ァ ルギニ ンのよ う な塩基性ア ミ ノ 酸 ； システィ ン、 シスチン、 メ チォニ ンのよ う な舍硫ア ミ ノ 酸 ； フ エ 二ルァ ラ ニ ン、 チ ロ シ ンのよ う な芳香族ア ミ ノ 酸 ； ト リ フ。 ト フ ア ン、 ヒ ス チ ジ ン のよう な複素環式ア ミ ノ酸 ； プロ リ ン、 4 —ヒ ドロキ シプロ リ ンのようなィ ミノ酸に由来する残基が挙げられる。 また、 このア ミノ酸残基の or —ァミ ノ基もしく はィ ミ ノ基に結合す る水素原子またばァ ミノ酸誘導体の残基 〔 X —で示される〕 の該残基としては、 単一のア ミノ酸または α —ア ミノ基を介 してペプチ ド結合し得るものであれば、 その構成ア ミ ノ酸残 基の種類およびペプチ ドの鎮長に制限はな く 、 さ らにその構 成ァミ ノ酸残基にリ ン酸も し く は糖またはその他の置換基が 共有結合していてもよ く、 また脂質と複合体を形成していて もよい。 前記置換基の具体的なものとしては、 それぞれのァ ミノ酸残基に対応して、 アル'ギニン残基のグァニジノ基に置 換する基、 例えば、 メ チル基もし く はェチル基などのアルキ ル基またはアデノ シンニリ ン酸リ ボース、 シ トルリ ンも し く はオル二チンに由来する残基 ； リ ジン残基の ε —ァ ミ ノ基に 置換する基、 例えば、 ダルコ シル基、 ピリ ドキシル基、 ピオ チュル基、 リボイル基もし く はァセチル基またはリ ン酸、 δ 一水酸基を有する化合物、 5 —グリ コ シル基を有する化合物. グルタルアルデヒ ドもしく は無水シ トラコ ン酸に由来する残 基； ヒスチジン残基のィ ミダゾ一ル基に置換する基、 例えば. メ チル基、 リ ン酸基も し く はョー ド原子またはフラ ビンに由 来する残基 ； プロ リ ン残基に置換する基、 例えば、 水酸基、 ジ水酸基もし く はグリ コ シルォキシ基 ； フヱニルァラ二ン残 基のベンゼン環に置換する基、 例えば、 水酸基もし く はグリ コ シルォキシ基 ； チロ シン残基の水酸基に置換する基、 例え ば、 グリ コ シルォキシ基、 スルホ ン酸基、 沃素原子、 臭素原 子も し く は塩素原子または水酸基を有する化合物、 ビスエー テル、 アデニン、 ゥ リ ジンも し く は R N A ( リ ボ核酸） に由 来する残基 ； セ リ ン残基の水酸基に置換する基、 例えば、 メ チル基、 グリ コ シル基、 ホスホパンテティ ン基、 アデノ シ ン ニ リ ン酸リ ボシルも し く はリ ン酸基 ； ス レオニ ン残基の水酸 基に置換する基、 例えば、 グリ コ シル基、 メ チル基も し く は リ ン酸基 ； システィ ン残基の S H基に置換する基、 例えば、 グリ コ シル基、 シスチニル基、 デヒ ドロアラニル基も し く は セ レ ン原子またはヘム も し く はフラ ビ ンに由来する残基 ； ァ スパラギ ン酸またはグルタ ミ ン酸残基のカルボキ シル基に置 換する基、 例えば、 メチル基、 リ ン酸基も し く は r —カルボ キシル基 ； ァスパラギンまたはグルタ ミ ン残基のァ ミ ド基に 置換する基、 例えば、 グリ コ シル基、 ピ口 リ ド二ル基も し く はィ ミ ノ基などが挙げられる。
    [0029] 上記基質と しての c末端残基にグリ シ ンがぺプチ ド結合し たペプチ ドまたはその誘導体は天然から抽出したものでも、 化学合成によって生産したものでも、 組換え D N A技術を用 いて生産したものでもよい。 従って、 本発明の基質、 式 （ I ) で示される化合物と しては、 ペプチ ド類、 例えば、 ア ミ ノ 酸 残基数 2 〜 100程度のぺプチ ド、 カゼイ ン、 プロテイ ンキナ ーゼ、 アデノ ウ イ ルス E I A蛋白質、 RA S 1 蛋白質などで代 表される リ ン酸ペプチ ドおよびその加水分解物、 ス ロ ンボブ ラスチン、 ct , リ ポ蛋白質、 リ ポビテ リ ンなどで代表される リ ポ琴白質およびその加水分解物、 へモグロ ビ ン、 ミ オグ口 ビ ン、 へモ シァニ ン、 ク ロ コ フ ィ ノレ、 フ ィ コ シァ ニ ン、 フ ビン、 口 ドプシ ンなどで代表される金属蛋白質およびその加 水分解物、 コ ラーゲン、 ラ ミ ニ ン、 イ ンターフ ェ ロ ン 、 セ ログリ コィ ド、 アビジンなどで代表ざれる糖蛋白質およびそ の加水分解物ならびにその他の C末端力ルボキシル基がァ ミ ド化されて成熟型の生理活性ペプチ ド、 例えばカルシ ト ニ ン、 セ ク レチ ン、 ガス ト リ ン、 血管作用性小腸べプチ ド （ V I P), コ レ シス トキニ ン、 セノレレイ ン、 薛ポリ ペプチ ド、 成長ホル モ ン放出因子、 副腎皮質刺激ホルモ ン放出因子、 カルシ ト ニ ン遺伝子関連べプチ ド等を形成するべプチ ド類の C末端グリ シ ン付加体 （すなわち、 C末端カルボキ シル基とグリ シ ンの アミ ド結合化合物） が挙げられる。 これらのう ち、 本発明の 酵素組成物の酵素活性を確認するために好ましい基質として は、 例えば、 D—チロ シルバリ ルグリ シ ン（D-Tyr- Va卜 Gly) 、 D—チロ シル ト リ プ ト フ ァ ニルグリ シ ン（D- Tyr-Trp-Gly) 、 グリ シルフ ェニルァラニルグリ シ ン（Gly-Phe- Gly) 、 フエ二 ルァ ラ 二ルグリ シルフ ュ ニルァラ ニルグ リ シ ン（Phe- Gly-Phe -Gly) 、 D—チロ シノレ 口 イ シルァスノヽ'ラギニノレグリ シ ン（D - Tyr-Leu-Asn-Gly)、 ア レギニノレフエ ニノレア ラ ニクレグ リ シ ン (Arg-Phe-Gly) 、 アクレギ二 レア ラニルアルギニノレロ イ シルグ リ シ ン（Arg— Ala-Arg— Leu— Gly) 、 口 イ シノレメ チオニ レグリ シ ン（Leu- Met-Gly) 、 グリ シスレロ イ シルメ チォニルグリ シ ン (Gly-Leu-Met-Gly) 、 フエニスレアラニノレグリ シノレ口 イ シクレメ チォニルグリ シ ン（Phe- Gly- Leu-Met-Gly) 、 ァ スパラギニル アルギニルフ エ二ルァラ 二ルグリ シ ン（Asp- Arg- Phe- Gly) 、 ト リ プ ト フ ァ ニルァスノヽ'ラギニルアルギニルフ ェニルァ ラ 二 ノレグ リ シ ン（Trp-Asp- Arg-Phe-Gly) 、 ァ ラ ニノレフ エ ニ ノレア ラ ニルグ リ シ ン（Ala- Phe- Gly) 、 リ ジルァ ラ ニルフ ヱ 二ルァ ラ ニルグ リ シ ン（1^5- 13-卩116-61) 、 セ リ ルリ ジルァ ラ ニルフ ェ ニ ノレア ラ ニ ルグ リ シ ン（Ser-Lys-Ala-Phe-Gly) 、 ア ルギニ ルチ ロ シルグリ シ ン（Arg- Tyr- Gly) 、 グ リ シルメ チォニルグ リ シ ン（Gly- Met- Gly) 、 グ リ シルチ ロ シルグリ シ ン（G 1 y - Ty r -Gly) 、 グ リ シルヒ スチジルグ リ シ ン（G 1 y - H i s - G 1 y) 、 ヒ ス チジルグ リ シルグ リ シ ン（H i s - G 1 y - G 1 y ) 、 ト リ プ ト フ ァ ニル グ リ シルグ リ シ ン（Trp - G 1 y - G 1 y ) およびグリ シルシステ ィ 二 ルグリ シン（Gly- Cys- Gly) 等が挙げられる、 （なお、 グリ シ ンを除き D—と特に示さないものは L—型を示す） 。 一方、 本酵素組成物の有効利用 （後述する第三の本発明） に好ま し い基質としては、 前記 C末端カルボキシル基がァ ミ ド化され て成熟型の生理活性ペプチ ドを形成する、 その C未端カ ルボ キ シル基にグリ シ ンがァ ミ ド結合したぺプチ ド類が挙げられ る。
    [0030] これらの基質に作用して、 次式
    [0031] ( H )
    [0032] X— N— A - C0NHz , ( Π )
    [0033] (上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示される C 末端ア ミ ド化物とグリ オキ シル酸の生成反応に関与するとは、 前記式 （ I ) の基質を式 （ Π ) の C末端ア ミ ド化物に転化す る主要な反応段階を促進する こ とをいい、 式 （ D ) で示され る C末端ア ミ ド化物前駆体の生成を触媒し、 その前躯体が通 常の加水分解反応等により式 （ Π ) の化合物を生成する場合 をも舍む概念である。
    [0034] また、 前記生成反応に実質的に悪影響を及ぼさない純度と は、 本発明の酵素組成物に夾雑蛋白質性成分が共存する場合、 それらが式 （ n ) で示される生成物の常法による分離精製に 悪影響を及ぼさないことをいう。 具体的には、 HPLCにて分折 すると本発明の酵素組成物に由来するピークが、 前記式 （ H ) で示されるア ミ ド化物のピークに比べてはるかに少な く なり、 式 （ Π ) で示される生成物を常法のペプチ ドまたは蛋白質分 離精製手段により容易に単離できることをいう。 より具体的 には、 3 7 'Cで 5時間反応させる場合、 式 （ I ) の前記反応 系の基質を式 （ H ) の生成物に 5 0 %以上転化する量の酵素 組成物を添加し、 反応後 HPLCで分折した時に、 該酵素組成物 由来の蛋白質性成分のピークが、 前記生成物ピークの 2 0 % 以下となる酵素純度、 を有することをいう。 換言すれば、 ブ タまたはゥマの血清に由来する前記反応の比活性を基準にす ると、 その比活性が約 150倍以上に上昇していることをいう。 なお、 比活性は、 後述する反応条件下における蛋白質 i rag当 りの活性である。
    [0035] 本発明における C末端ァ ミ ド化酵素組成物の供給源として の血清及び血漿の由来動物としては、 ヒ ト、 ゥ シ、 ゥマ、 ブ タ、 ヒッジ、 ゥサギ、 ャギ、 ラ ッ ト、 マウス等の哺乳類、 二 ヮ ト リ 、 シチメ ンチョ ゥ等の鳥類、 力ェル等の両生類、 へビ 等のハ虫類、 イ ワ シ、 サバ、 ゥナギ、 サケ等の魚類が挙げら れる。 血清及び血漿は、 直接血液から諷製したものでも市販 のものでも良い。 血液から調製する際には以下のよう に して 得る。 採血については、 例えば、 "生化学ハ ン ドブッ ク、
    [0036] 723頁一 725頁" 鈴木著 丸善（1 984 )に記載されているよ う な一般的に用いられている方法で良い。 ただし血清を得る場 合には、 へパリ ン、 エチ レンジァ ミ ン 4酢酸及びそのナ ト リ ゥム塩、 クェ ン酸ナ ト リ ウム等の抗凝固剤を使用してはなら ない。 血清の調製は、 例えば、 "続生化学実験講座、 第 5卷. 9頁" 松橋ら著、 東京化学同人（1 986)、 あるいは "続生化学 実験講座、 第 8巻、 下巻、 682頁" 松本ら著 東京化学同人 ( 1 987 )に記載されているように行えば良く 、 例えば、 採血し た血液を 20〜 40てで少な く とも 3 0分放置し、 血餅を十分に 沈降させ、 その上澄を得るこ とで達成できる。 上澄を取る際、 必要であれば遠心分離、 濾過等を行う。 また、 血漿の調製は、 例えば、 "生物学辞典、 第 2版、 332頁— 333頁" 、 岩波 ( 1 977 )に記載されているように、 前記の抗凝固剤を採血時あ るいは採血後直ちに添加する力、、 0 〜 1 0 'Cの低温で少な く とも 1 0分間放置して血液凝固進行を阻止した上で、 有形成 分を沈降させ、 その上澄を得るこ とで達成できる。 この場合 も必要であれば遠心分離、 濾過等を行う。 血清および血漿は、 一 80て〜 10 'Cの低温で保存するが、 数回の凍結融解では C末 端ア ミ ド化酵素組成物の活性は低下しない。
    [0037] 本発明のア ミ ド化酵素組成物は、 さ らに以下の理化学的性 質により特定される。 すなわち、
    [0038] ( i ) 至適 P Hが約 6. 0 で、 かつ安定 P Hが 5 〜 9 にあり、
    [0039] ( ϋ ) 作用適温が約 25〜 40ての範囲にあり、
    [0040] ( iii ) 金属イ オ ンおよび L ー ァス コ ルビ ン酸を補因子とし、 ( iv ) ゲル濾過による分子量決定法により約 50, 000およびノ またば約 100, 000の分子量を有し、
    [0041] ( V ) 等電点ク ロマ トグラフィ 一により ρΗ4. 5および/また は 6. 7付近に等電点を有し、 ならびに
    [0042] C vi ) カタラーゼの添加により活性化される。
    [0043] 上記 （ i ) および （ ) の性質ば、 通常使用される緩衝液、 具体的には、 ト リ スー塩酸、 メ ス—水酸化カ リ ウム、 テス一 水酸化ナ ト リ ウム、 へぺス一水酸化力 リ ゥム緩衝液を用いて 測定したものである。 なお、 本発明の酵素組成物は、 1 て〜 5 5 ての温度範囲内で前記反応を触媒するが、 5 6 'Cでは約 1 0分で失活し、 4 5 'C付近でも若干の失活がみられる。
    [0044] 金属イ オンとしては、 Cu2+ , N iz+ , Co2+ , F e3+ 等 が適当であり特に Cu2+ が好ましい。 これらの金属イオンお よび L 一ァスコルビン酸は捕因子（cofactor)として機能する と考えられる。 なお、 NADHもしく は NADPH などの還元剤、 ド —パミ ンも しく はノルェピネフエ リ ンなどのカテコールァ ミ ン類も L ーァスコルビン酸と同様な挙動を示す。
    [0045] また、 本発明の酵素組成物は、 前逑のような特性を有し、 複数の酵素活性物質を舍む混合物であってもよいが、 それら の活性物質が単離された、 すなわち、 それぞれ分子量約
    [0046] 50, 000または約 100, 000の個別の活性物質からなる酵素組成 物 （または、 酵素自体） をも包含する。
    [0047] 分子量は.、 それ自体公知のゲル濾過法 〔½えば、 "生化学 実験講座 5、 酵素研究法、 上巻、 283〜 298頁" 、 東京化学 同人（19了5)〕 に従い測定した値である。 具体的には、 lOOmM の塩化カ リ ウムを舍む 5 O mMの ト リ ス—塩酸 （PH 7. 4 ) を平 衡化および溶出液として用い、 ト ヨパール HW— 55S (東ソ一社 製） 上でゲル濾過を行い、 一ア ミ ラーゼ（M.W.200, 000) 、 アルコールデヒ ドロゲナーゼ（M. W. 150, 000) 、 BSA (M. W. 66, 000) 、 カルボニ ッ クア ンヒ ドラーゼ（M.W.29, 000)および チ ト ク αム C (M. W.15, 400)を指標として決定した。
    [0048] 等電点は、 それ自体公知の等電点ク ロマ トグラフ ィ ー （ク ロマ ト フオーカ シング） 〔例えば、 "続生化学実験講座 2、 タ ンパク質の化学、 上巻、 160〜 171頁" 東京化学同人 (1987) ] に従い測定した値である。 具体的には、 Mono Pカ ラ ム （ 0. 5 X 2 0 on) (フア ルマ シア社製） を用い、 2 5 mMのィ ミダゾールー塩酸 （pH 7. 4 ) で平衡化し、 同じ緩衝溶媒系に 置換したサ ンプル ^添加した後、 ポリ ノ ッファー 7 4 (ファ ルマシア社製 ： 8倍希釈、 塩酸で pH 4. 0 に調整） で溶出して 測定した。
    [0049] 酵素組成物の調製
    [0050] 以上の本発明の酵素組成物は、 もう一つの本発明である、 以下の調製方法により得るこ とができる。 すなわち、 血清ま たは血漿を前記式 （ I ) で示される C末端グリ シ ン付加体を リ ガン ドとする基質親和性ク ロマ トグラフ ィ ーを用い、 必要 により、 酵素の精製に常用される
    [0051] ( 1 ) 沈穀による分画、
    [0052] ( 2 ) へパリ ン親和性ク ロマ トグラフ ィ ー、 およびノまたは ( 3 ) 透析、 ゲル濾過等による低分子物質の除去方法、 とを 組み合わせ使用することにより得る こ とができる。 本発明のリガン ドとしては、 前述の式 （ I ) で示される C 末端グリ シ ン付加体であればすべて使用できるが、 前記の本 発明の酵素組成物の酵素活性を確認するために好ま しいもの として具体的に列挙したグリ シンを舍め 2 〜 6個のァ ミ ノ酸 残基からなるペプチ ド類が挙げられる。 これらのう ち、 D-Tyr -Trp-Gly, Phe-Gly-Phe-Gly および G ly - Phe- G I y がより好ま しいものであるが、 Phe- Gly- Phe-Gly をリガン ドとするもの が、 本発明の酵素組成物に強い親和性を有することから特に 好ま しい。
    [0053] これらのリガン ドは、 通常、 水不溶性担体に結合せしめて 使用されるが、 リ ガン ドとじて用いられるペプチ ドの C末端 グリ シン残基のカルボキシル基は、 遊離の状態であることが C末端ァ ミ ド化酵素との結合に重要であり、 N末端のァ ミノ 酸残基のァ ミノ基を介して担体と結合させる必要がある。 す なわち、 担体としては、 ペプチ ドのア ミノ基と結合可能なも のであれば何でもよ く、 またア ミノ基と反応する活性基を担 体に化学的に導入しても、 また、 既に導入された市販の担体 を使用してもよい。 化学的に導入する方法は、 一般に使用さ れている方法でよ く、 例えば、 "生化学実験法第 5巻上巻
    [0054] 257頁〜 281頁" 笠井著 東京化学同人（1975)に記載されて いるように、 例えばァガ π—スに臭化シアンを用いて、 ィ ミ ドカルボキシル基を導入する。 市販されている活性化された 担体は、 基林を指標とすると、 例えばァガロース系、 セル π —ス系、 親水性ポリ ビニール系等があるが、 これらどれを用 いても構わない。 ァガロース系担体としては、 リ ガン ドのァ ミ ノ 基との結合方法に CNBr法を用いる CNBr活性化セフ ァ ロー ス 4 B (フ ア ルマ シア社製） 、 カ ルボジィ ミ ド法を用いる C H —セフ ァ ロース 4 B、 E C H —セフ ァ ロ一ス 4 B (以上 フ ア ルマ シア社製） 、 ァフ ィ ゲル 1 0 、 ァフ ィ ゲル 1 5 (以 上、 ノ ィ オラ ッ ド社製） 、 ト レシルク 口 ラ イ ド法を用いる ト レ シル活性化セ フ ァ ロース 4 B (フ ア ルマ シア社製） 等が挙 げられる。 セルロース系担体と しては、 ホル ミ ル法を用いる ホル ミ ルセル口フ ァ イ ン （チ ッ ソ社製） が挙げられる。 親水 性ポ リ ビニール系担体と しては、 力ルボジィ ミ ド法を用いる A F —カルボキ シ ト ヨ ノ ール 650 、 ホル ミ ル法を用いる A F ーホノレミ ノレ ト ヨノヽ'一ル 650 、 ト レ シノレク ロ ラ イ ド法を用いる A F — ト レ シル ト ヨバール 650 、 エポキ シ活性化法を用いる A F —エポキシ ト ヨパール 650 (以上東ソ一社製） 等が挙げら れる。 リ ガン ドとの結合反応はそれぞれの担体の使用説明書 に従い反応させれば良い。
    [0055] このう ち、 ァフ ィ ゲル 1 0 について作製方法を記載する。 ァフ ィ ゲル 1 0 とペプチ ドとの反応は 0.001〜 1 M好ま し く は 0. 1 Mのモ ッ ブス—水酸化力 リ ゥム等の緩衝液中で行う。 反応条件は 0〜 2 0 て、 1 0分〜 2 4時間、 pH 3 〜 1 1 程度 が可能であるが、 好ま し く は 4 て、 4 〜 2 4 時間、 PH 5〜 9 の条件で行う。 ァフ ィ ゲル 1 0 と結合に用いるペプチ ドの混 合比は、 ァフ ィ ゲル 1 に対し、 ペプチ ドが約 2 5 mo ま では多 く 加える程多 く 結合するので、 その範囲内でい く らで もよいが、 結合効率の点から 1 〜 2 0 μ mojg 程度が好都合に 用いられる。 反応後、 反応時に用いた緩衝液で十分に洗浄後、. ト リ スー塩酸 （pH 8* 0 ) を最終濃度 5 0 mMになるように添加 し、 4てで 1時間振盪させる等の方法で未反応の活性基をブ ロ ックする。 以上で基質親和性ゲルが作製される。
    [0056] 基質親和性ク 口マ トグラフィ ーは、 ノ ッチ式でもカ ラムに 充填して連続式に行ってもよい。 試料とゲルを接触させる時 間は、 C末端ア ミ ド化酵素が十分に吸着する程度であればよ いが、 通常、 2 0分〜 2 4時間である。 ゲルの平衡化に用い たものと同じ組成の低イ オ ン強度で pHが 6. 0〜： 11 . 0好ましく は 7. 0 〜 9. 0 の緩衝液、 例えば 1 0 mMへぺスー水酸化力 リ ウ ム ( pH 7. 0 ) で非吸着成分を十分に洗い出す。 そののち、 C 末端ァ ミ ド化酵素活性の存在する画分を溶出する。 溶出液は- C末端ァ ミ ド化酵素が効率良く得られる組成であれば何でも よいが、 好ましいものとしては、 1 〜 4 0 %程度のァセ トニ ト リルと共に 0. 1 〜： L 0 M塩化ナ ト リ ウムを舍む pH 7. 0 〜 9. 0 の間の緩衝液、 例えば 2 0 %ァセ トニ ト リル、 0. 4 M塩 化ナ ト リ ウムを舍む 1 0 mMへぺス—水酸化ナ ト リ ウム （pH 7. 0 ) が挙げられる。 また、 溶出はカラムに充塡した場合、 濃度勾配をかけても構わない。
    [0057] また、 場合により、 前記基質親和性ク 口マ トグラフ ィ 一 〔以下、 （ 4 ) で表す〕 工程を実施する前または後、 あるい は前後両方に先に掲げた沈澱による分面 〔以下、 （ 1 ) で表 す〕 、 へパリ ン親和性ク 口マ トグラフィー 〔以下、 （ 2 ) で 表す〕 およびノまたは透圻、 ゲル濾過等による低分子物質の 除去 〔以下、 （ 3 ) で表す〕 工程を実施してもよい。 一般的 に、 これらの総数 1 〜 6工程を実施し、 さらに上記 （ 4 ) ま たは （ 3 ) 工程を最終段階に実施する こ とが好ま しい。 各ェ 程の組み合わせの具体例と しては、 （ 4 ) のみ、 （ 1 ) → ( 4 ) , ( 4 ) → ( 3 ) , ( 2 ) → ( 4 ) , ( 1 ) - ( 3 ) →
    [0058] ( 4 ) , ( 2 ) → ( 3 ) - ( ) , ( 1 ) → ( 4 ) - ( 3 ) , ( 2 ) 4 ) → ( 3 ) , ( 2 ) → ( 1 ) → ( ) , ( 1 ) → ( 2 ) →
    [0059] ( 3 ) - ( 4 ) , ( 1 ) - ( 2 ) → ( 4 ) → ( 3 ) ( 1 ) ->
    [0060] ( 3 ) - ( 4 ) - → ( 3 ) ( 1 ) → ( 2 ) → ( 1 ) → ( 4 ) , ( 1 ) - ( 2 ) - - ( 1 ) → ( 3 ) → ( 4 ) , ( 2 ) 1 ) →
    [0061] ( ) - ( 3 ) , ( 2 ) - ( 1 ) → ( 3 ) → ( 4 ) ( 2 ) → ( 1 ) - ( 3 ) - - ( ) → ( 3 ) , ( 1 ) → ( 2 ) 3 ) →
    [0062] ( ) - ( 3 ) , ( 1 ) — ( 3 ) - ( 2 ) → ( 3 ) ( ) , C 1 ト ( 3 ) - - ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 3 ) , ( 4 ) →
    [0063] ( 3 ) - ( 4 ) , ( 4 ) - ( 3 ) ( 4 ) ( 3 ) また-は ( 1 )
    [0064] → ( 4 ) 3 ) → ( 4 ) ( 3 ) 、 等が挙げられる。 これ らのう ち、 （ 1 ) → ( 2 ) → ( 3 ) → ( 4 ) , ( 1 ) → ( 2 ) → ( 3 ) → ( 4 ) → ( 3 ) , ( 1 ) → ( 3 ) → ( 2 ) → ( 3 ) → ( 4 ) または （ 1 ) → ( 3 ) → ( 2 ) → ( 3 ) → ( 4 ) → ( 3 ) の順に工程を進めるのがよ り好ま しい。
    [0065] 以下、 前記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) 工程についても詳細に説明する。 なお、 これらはすべて 0 て〜 1 0 て、 好ま し く は 4 てで行う。
    [0066] ( 1 ) の沈澱による分画に使用される物質と しては、 硫酸 ア ンモニゥム等の塩類、 エタノ ール、 アセ ト ンなどの有機溶 媒、 ポ リ エチレ ングリ コール等のポ リ マ ー類が挙げられる。 添加する濃度は、 特に制限はないが、 C末端ア ミ ド化酵素が 収率良 く 回収でき、 しかも他の蛋白質成分と分離でき る条件 が好ましい。 例えば、 30〜50%飽和硫酸ア ンモニゥム、 10〜 15% (w/v)ポリ エチレングリ コール 6ひ 00の添加では、 C末端 ア ミ ド化酵素は沈澱画分に来るのに対し、 血清及び血漿中に 多く舍まれるアルブミ ンは上澄部分に存在するので、 効率よ く精製される。 なお添加は、 スターラーで撹拌しながら序 に行うのが好ましい。 添加終了後少なく とも 1時間以上静置 したのち、 遠心分離により、 C末端ア ミ ド化酵素の存在する 画分を回収する。 沈澱画分を回収した時には、 これを適当な 緩衝液に溶解する。 緩衝液、 P 1H 86. 0 〜： 11.0、 好まし く は PH 7. 0 〜 9. 0であれば組成は何でもよ く、 例としては、 ト リ ス —塩酸、 へぺス一水酸化力 リ '—ケム、 テス—水酸化ナ ト リ ウム 等が挙げられる。 また濃度は、 緩衝能を保てる範囲であれば 特に制限はないが、 5 〜 5 O raM程度が好ましい。
    [0067] ( 1 ) によって得た活性画分は、 次に、 再度 （ 1 ) を行つ ても （ 2 ) 〜 （ 4 ) のう ちの 1つの工程いずれに進んでもよ いが、 （ 1 ) の分画に硫酸ァンモユウム等の塩類を使用し、 ( 2 ) か （ 4 ) に進む時は、 （ 3 ) の工程か、 あるいは適当 な緩衝液を添加して次の工程で用いるゲルに C末端ア ミ ド化 酵素が結合可能な塩濃度に下げる必要がある。 また、 沈鏺を 溶解して 1時間以上静置した場合や、 透折を行った場合には 不溶性の物質が生じるこ とがあるので、 これを例えば、 遠心 分離や濾過を行って除去する。
    [0068] ( 2 ) のへパリ ン親和性ク ロマ トグラフ ィ 一については、 バッチ式でもカラムにゲルを充塡して連鐃式に行ってもよい へパリ ンをリ ガン ドとしたゲルは、 市販されているものと し て、 へノ、。 リ ンセ フ ァ ロ一ス CL— 6B (フ ア ルマ シア社製） 、 ァ フ ィ ゲルへパ リ ン （バイ オ ラ ッ ド社製） 、 へパ リ ンァガ ロ ー ス （ シグマ社製） 、 A F —へパ リ ン ト ヨパール 650 (東ソ 一社 製） 等がある。
    [0069] 血清及び血漿を直接、 あるいは （ 1 ) に示した沈殺による 分画の処理を行ったのち、 へパリ ン親和性ゲルと接触させる , 接触時間は、 C末端ア ミ ド化酵素が十分に吸着する程度であ ればよいが、 通常は 2 0分〜 1 2時間である。 へパリ ンに親 和性のない成分を、 C末端ア ミ ド化酵素が溶出されない程度 にィォン強度が低く、 pHが 6. 0〜11.0好ま し く は 7. 0〜 9. 0 の緩衝液、 例えば、 1 0 のへぺス一水酸化カ リ ウ ム （pH 7. 0 ) で十分に除去する。 そののち、 C末端ア ミ ド化酵素を 舍む画分を溶出する。 溶出液としては、 C末端ア ミ ド化酵素 活性の回収率が高いものがよ く、 例えば、 0. 5 M— 2 Mの塩 化ナ ト リ ウ ム、 塩化カ リ ウ ム、 硫酸ア ンモ ニゥム等一般に酵 素精製に用いられる塩類を含む PH 6. 0〜11.0を有するものが 好ま しい。 溶出は、 カ ラ ムに充塡してある場合、 塩濃度勾配 によって行っても構わないが、 一段階溶出の方が回収率が高 いので好ま しい。 例えば、 0. 3 — 2. 0 Mの塩化ナ ト リ ウ ムを 舍む 1 0 へぺス—水酸化カ リ ウ ム緩衝液 （pH7. 0 ) で溶出. する。
    [0070] ( 2 ) の工程で得た活性画分は、 次に （ 1 ) 〜 （ 4 ) いず れの工程に供してもよいが、 再度 （ 2 ) を行ったり、 （ 4 ) に進む場合には、 （ 3 ) を先に行う力、、 多量の 5 0 以下の 低イ オ ン強度の pH 6. 0 〜： L1.0、 好ま し く は 7. 0 〜 9. 0 の緩衝 液、 例えば 5 mMへぺス一水酸化カ リ ウム (pH7. 0 ) 等を加え て （ 2 ) , ( 4 ) で使用するゲルに C末端ァ ミ ド化酵素が吸着 できるイ オン強度にまで下げる必要がある。
    [0071] ( 3 ) の透折、 ゲル濾過等による低分子物質の除去の工程 であるが、 透折の場合、 使用する膜は、 C末端ア ミ ド化酵素 が通過できない程度の分画分子量のものであればよいが、
    [0072] 1,000〜10,000が好ましい。 透折の方法は、 例えば、 "生化 学実験講座第 5卷上卷 252頁〜 253頁" 左右田著 東京化学 同人（1975)に記されているような一般に使用されるものでよ く、 数時間〜数日、 イ オン強度の低い、 PH 6. 0〜11.0、 好ま し く は PH7. 0〜 9. 0 の緩衝液、 例えば 1 0 mMへぺス—水酸化 カ リ ウム （pH7. 0 ) 、 1 0 mMト リ ス一塩酸 （pH 7. 5 ) 等に対 して行う。 また、 透折の際、 不溶性の物質が圻出した場合に は、 例えば遠心分離、 濾過等によって除去する。
    [0073] ゲル濾過については、 一般的にゲル濾過用担体として用い られるものであれば何でも搆わない。 例えばセフアデックス G -10 , G— 15 , G -25 , G -50 G -75. G -100 、 セフ ア ク リ ル S — 200 , S— 300 (以上フアルマシア社製） ト ヨパ —ル HW— 40 (東ソ一社製） 、 ノ、、ィォゲル P — 2 , P - 4 , P — 6 (以上バイォラ ッ ド社製） 等が好ましい。 なお、 使用 すべき緩衝液は、 透折の際に用いるべき組成と同様である。 ただし、 ィォン強度があまりに低いと、 C末端ァ ミ ド化酵素 のゲルへの吸着が起こることが考えられるので、 濃度を 5〜
    [0074] 200mM好まし く は 10〜20mMにする。 ゲル濾過の方法は、 例え ば、 "生化学実験講座第 5巻上巻 283頁〜 298頁" 左も田著 東京化学同人（1975)に記載されているように行えば良い。 ゲ ル濾過担体のベッ ド体積に対し十分な分離能が得られる量 (べッ ド体積の 2 0 %以下） の試料を添加後、 溶出を行い、 C末端ア ミ ド化酵素活性の存在する画分を回収する。
    [0075] ( 3 ) の工程によって得られた活性画分は、 特別な処理な しに （ 1 ) 〜 （ 4 ) の各工程に進めるこ とができる。
    [0076] 以上の精製工程を経ることにより、 通常 C末端ア ミ ド化酵 素の比活性が 150倍以上に上昇した本発明の酵素組成物が得 られる。 かかる、 酵素組成物は、 さ らに （ 3 ) のゲル濾過ェ 程を用いるタ ンパク質分離手段により、 それぞれ分子量約 50, 000および約 100, 000にピークを有する画分に単離する こ とができる。
    [0077] 以上の各工程は、 それぞれ C末端ァ ミ ド化酵素活性を追い、 活性画分を得ることによつて実施される。
    [0078] C末端ア ミ ド化酵素活性の測定は、 ア ミ ド化反応を確認で きる方法であれば何でもよ く 、 例えば、 125 I — D —チロ シ ルバリ ルグリ シ ン（' 25 I -D-Tyr-Val-Gly) を基質として反応 し、 イ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ーで基質と反応生成物を分 離する E i pperりの方法 （Eipperら、 Pro. Natl . Acad. Sci . U.S.A. 80. 5144, 1983)、 あるいは、 125 I — Ac —チロ シルフ ェ ニ ルァ ラ二ルグ リ シ ン 5 I - Ac- Tyr-Phe-Gly)を基質と して反 応し、 酢酸ェチルで反応生成物を抽出する水野らの方法
    [0079] (Mi zunoり、 Biochem.Bioph s. es.Commun. , 137 , 98 , 1986) あるいは、 Ν - dansyl—チ 口 シルバリ ルグ リ シ ン（N- dansy卜 Tyr- Val-Gly)を基質として反応し、 高速液体ク ロマ トグラ フ -4一（HPLC)で基質と反応生成物を分離する Jonesらの方法 (Jonesら、 Anal.Biochem. , 168 ,272, 1988)、 あるいは、 酵素 反応生成物であるグリ オキシル酸.を定量する amerらの方法 (Ramerら、 J. Am. Chem. Soc. , 110 ,8526, 1988) 等が挙げられ る。 以下に本発明で用いた前記 Eipperらの方法に準ずる C未 端アミ ド化酵素活性の測定方法を具体的に示す。
    [0080] 酵素活性の測定方法
    [0081] 反応液は、 5 0 mMへぺス—水酸化カ リ ウム緩衝液 （ pH 7. 0 ) 1 0 M硫酸銅 1. 5 mM L —ァスコルビン酸、 4 gカタラーゼ (シグマ社製） 2 D-Tyr-Val-Gly. 20, OOOcpm の 1 25 I -D -Tyr-Val-Glyならびに C末端ケミ ド化酵素溶液を添加し、 水 で全量 8 0 Wとした。 反応液を 3 7 'C恒温水槽中で、 振盪し ながら 2時間または 5時間反応させた。 2 mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （PH5. 0 ) を 1 添加し反応を停止した。 反応生成 物と基質ば、 S P —セフアデッ クス C 一 50 (フアルマシア社 製） イ オン交換カラムクロマ トグラフィーにより分離した。 べッ ド体積 2 のイオ ン交換ゲルに反応液を通し、 2 mMリ ン 酸ナ ト リ ゥム緩衝液 1 0 で未反応基質を洗い流し （溶液 A) 反応生成物のみをゲルに吸着させた。 次に 0, 5 M塩化ナ ト リ ゥムを舍む 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ pH 5. 0 ) 2. 5 を用い、 反応生成物を溶出した （溶液 Β ) 。 溶液 Αと溶液 Β の放射活性を r 一カウ ンタ一により測定し、 基質変換率を次 式により求めた。 基質変換率 ( % ) =
    [0082] 溶液 Bの放射能
    [0083] X 100
    [0084] 溶液 Aの放射能十溶液 Bの放射能
    [0085] 酵素活性 1 ( U ) は、 1 時間当たり 1 pmo の基質を変換 する活性と定義した。 また、 比活性は蛋白質 1 rag当たり の活 性とした。
    [0086] 酵素組成物の使用
    [0087] 本発明の酵素組成物の使用に関する次の、 第三の本発明、 すなわち、 前記式 （ I ) で示されるグ リ シ ン付加体を、 前記 酵素組成物あるいはゥマまたはブタの血清または血漿で処理 することを特徴とする前記式 （ Π ) で示される C末端ァ ミ ド 化物の製造方法が提供される。
    [0088] この製造方法は、 反応混合物からの生成物、 式 （ Π ) の化 合物の単離精製を考慮すると夾雑タ ンパク質が大幅に除去さ れた本発明の酵素組成物を使用するのが有利であるが、 ゥマ またブタの血清または血漿を使用するなら、 そのまま、 ある いは単にそれらの濃縮物をも使用するこ とができる。
    [0089] 式 （ I ) の化合物と しては、 前述のものが全て舍まれるが、 本発明の目的に沿う、 特に式 （ D ) の化合物、 例えばアルギ ニ ンバソ ト シ ン （ A V T ) 、 黄体形成ホルモ ン放出ホルモ ン (LH - RH) 、 ォキ シ ト シ ン、 ガス ト リ ン、 ガス ト リ ン分泌促 進ペプチ ド（GGRP)、 カ ルシ ト ニ ン （ C T ) 、 血管作用性小腸 ペプチ ド （ V I P ) 、 甲状腺刺激ホルモ ン放出ホルモ ン ( T R H ) 、 黒色素胞剌激ホルモ ン （ M S H ) 、 M S H放出 抑制ホルモ ン （ M I H ) 、 コ レ シス ト キ ニ ンォク タぺプタ イ ド（CCK - 8 ) 、 サブスタ ンス P ( S P ) 、 脂肪動員ホルモン、 薛ポ リ ペプチ ド （ P P ) 、 成長ホルモ ン放出因子、 セ ク レチ ン、 セルレイ ン、 軟体動物性心臓興奮性神経ペプチ ド、 バソ プレ ツ シ ン、 副腎皮質刺激ホルモ ン（A CTH)、 変色ホルモ ン、 ボンべシ ン、 明順応ホルモン、 モチ リ ン、 ァパミ ン、 ァ リ テ シン、 エ レ ドイ シ ン、 カ ッ シニ ン、 グラ ニユ リ べリ ン R、 ス コ トホビン、 ヒ ラ ンべ一ト セルレイ ン、 肥満細胞脱穎粒ぺプ チ ド、 フ ィ サ レ ミ ン、 フ ィ ロ セルレイ ン、 フ ィ ロメ ズシ ン、 プロ メ リ チン、 ボ ンビニン、 マス トノヽ'ラ ン、 マス トノヽ'ラ ン一 X、 メ リ チ ン一 1 、 ラナテ ンシ ンおよびラ ナテ ンシ ン一 R等 の C末端力ルバモィ ル基 （ _ C0NH 2 )が C末端力ルボキ シル基 とグリ シ ンのァ ミノ基とのペプチ ド結合した基（一 C0N HCH 2 C00H) で置換した化合物が好ましい。 これらのペプチ ドは、 それ自 体公知のぺプチ ド合成法または組換え D N A技術を使用して 製造することができる。
    [0090] 前記処理は、 通常の锾.衝液中で実施することができるが、 それぞれ適当量の金属ィオン、 L 一ァスコルビン酸等及び力 タラ一ゼの存在下で実施することが好ましい。
    [0091] 緩衝液中の式 （ I ) の化合物濃度は特に制限がなく任意に 変化させることができるが、 通常 0. 1 ^！〜 2 mM程度が適当で ある。
    [0092] 緩衝液の PHは 5〜 1 0、 好ま しく は pH 7付近が適当である。 かかる緩衝液をつく るための緩衝剤は特に制限されず通常使 用されるものが用いられる。 例えば ト リ ス ー塩酸、 へぺス — 水酸化力 リ ゥムがあげられる。 緩衝液中の緩衝剤の濃度は緩 衝作用が達成される限り いかなる濃度でもよいが、 通常は 20 〜 200mMが適当である。
    [0093] 金属イ オ ンと しては C u2 + , N i 2 + , C oz + , F e3 + 等が 適当であり特に C uz + が好ま しい。 金属イ オ ンの緩衝液中の 濃度は 0 〜1000 、 好ま し く は 0 〜 200 、 さ らに好ま し く は 0.01〜 50^が適当である。 かかる金属イ オ ンを提供する化 合物は特に限定されないが CuS04 , CuCl z , NiCl 2 , CoCi 2 FeCl 3 等があげられる。
    [0094] L —ァスコ ルビン酸等と しては、 L —ァスコ ルビ ン酸、 NADHも し く は NADPH などの還元剤、 ドーパミ ンも し く はノ ル ェ ピネ フ ヱ リ ンのよ う な力 テコ 一ルァ ミ ン類が挙げられる。 L ーァズコ ルビ ン酸の緩衝液中の濃度は 0 〜 1 0 mM、 特に 0. 5 〜 2 mMが適当である。
    [0095] カタ ラーゼの緩衝液中の濃度は 0 〜 300 / ffl£、 好ま し く は 10〜 2Q0 utg / i 、 さ らに好ま し く は 40〜 100 /^が適当 である。
    [0096] ゥマまたはブタの血清または血漿あるいは前記酵素組成物 の使用量は特に限定な く 種々変化させる こ とができるが、 反 応系に存在する基質の量 （ a ナノ モル（nmol)とする） に対し、 好ま し く は a pmolZhr以上、 さ らに好ま し く は 10 X a pmol / hr以上、 もっ と も好ま し く は 10 X a pmolZhr a mol /hr 〔単位は酵素活性を示し、 3 7 て 1 時間で反応しう る基質量 (例えばピコモル（pmol)で表示する。 〕 のア ミ ド化酵素活性 を舍有している のが適当である。
    [0097] 酵素反応は 1 〜 5 5 て、 好ま し く は 25〜 4(TC、 も っ と も好 ましく は 3 7て付近で静置あるいは振盪して行う。 反応は通 常 1分〜 4 8時間で終了する。
    [0098] かかる処理により生成する式 （ D ) で示される C末端をァ ミ ド化したぺプチドまたはその誘導体の分離、 精製は、 ィォ ン交換ク ロマ トグラフィー、 逆相クロマ トグラフィー、 ゲル 濾過、 ァフィ 二ティーク ロマ トグラフィー、 高速液体ク ロマ トグラフィ ー（HPLC)、 薄層ク ロマ トグラフィ ー ( T L C ) な どで行う ことができる。 基質とアミ ド化された生成物は、 C 末端がそれぞれカ ルボキ シル 2基とア ミ ド基であり、 電荷が異 なっている。 この性質を用いたイオン交換ク ロマ トグラ フ ィ 一、 逆相ク口マ トグラフィ一な-どが好適である。 また、 生成 物の抗体を用いたァフィニティークロマ トグラフ ィ一も有効 である。 .
    [0099] 〔実施例〕
    [0100] 次に実施例によつて本発明をさ らに詳細に説明する。 なお 本発明はこれによって限定されるものではない。
    [0101] 実施例 1 基質親和性ク ロマ トグラフ ィー用ゲルの調製
    [0102] 5 のァフィゲル 1 0を、 イ ソプロパノ一ルを満たした 1 0 容ェコノ カ ラム （バイオラ ッ ド社製） に計り取った。 ィ ソプロパノールを流し出したのち、 5 0 の 1 0 m 酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ P H 4. 5 ) 、 次いで 1 0 の 0. 1 Mモ ップス —水酸化ナ ト リ ゥム緩衝液 （ 8 0 mM塩化力ルシゥムを舍む、 pH T. 5 ) で洗浄した。 ゲルを 2 0 容のビンに移したあと、 4 0 mg (約 100 u m o ^ ) のフ エ ニルァ ラ ニルグリ シルフ エ二 ルァ ラニルグリ シ ン（Phe-Gly-Phe-Gly、 シグマ社製） を溶解 した上記モ ッ プスー水酸化ナ ト リ ウム緩衝液 1 0 と混合し、 4 てで 1 8時間振盪反応させた。 そののち、 0. 5 の 1 M ト リ ス―塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) を加えて 4 てで 1 時間振盪反応 し、 未反応の活性基を不活化した。 ゲルをイ オン交換水で洗 浄後、 0.02%NaN3に懸濁し、 カ ラムに充塡、 4 てで保存した。 なお、 反応に供したペプチ ド（Phe-Gly-Phe-Gly) の量と回収 された溶液中のペプチ ド量から、 ゲル 1 ffl あたり約 1 0 / mo 結合していると算出された。
    [0103] 卖施例 2 ゥマ血清からの C末端ア ミ ド化酵素組成物の調製 ( 1 ) 市販のゥマ血清 （ギブコ社製） に、 ポリ エチ レ ングリ コール 6000 (和光純薬） 2 5 %水溶液（wZv)を 100 、 すなわち最終濃度 12.5%になるように撹枰しながら序々に添 加した。 なお、 以下すベて 4 'Cにて操作を行った。 1 2時間 静置後、 遠心分離 （ΙΟ,ΟΟΟΧ g、 1 0分） し、 得られた沈殺 を 120 の 1 0 mMへぺス一水酸化カ リ ウム緩衝液 （pH7. 0 ) に溶解した、 さ らに 2時 静置後、 生成した不溶性物質を再 び遠心分離 （ 10,000 X g、 1 0分） で除き、 C末端ア ミ ド化 酵素活性を舍む上澄（127 ) を得た。
    [0104] ( 2 ) 上記 （ 1 ) で得た活性画分を、 l O mMへぺス一水酸 化カ リ ウム緩衝液 （ pH 7. 0 ) で平衡化したへパリ ンセフ ァ ロ —ス CL— 6B (フ ア ルマシア社製） を充塡したカ ラム （ 1. 6 X 1 5 cm ) にかけた。 同緩衝液 9 6 で非吸着物質を洗い出し た後、 0. 5 M塩化ナ ト リ ウムを含む 1 0 mMへぺス一水酸化力 リ ウム緩衝液 （PH 7. 0 ) で溶出を行った （流速 3 0 ノ hr) 。 第 1図に溶出パターンを示した。 0. 5 M塩化ナ ト リ ウム舍有 緩衝液によって C末端ァミ ド化酵素は溶出された （フラ ク シ ョ ン番号 Νο.14〜16) が、 No.1 4 は蛋白質量が多く比活性が低 いことから、 Νο.15 , 16を集めた （ 1 6 ) 。 ·
    [0105] ( 3 ) 上記面分を、 スぺク ト ラ Zポア透折膜 （分画分子量 3500、 スペク ト ラム社） を用いて、 1 の 1 0 mMへぺス一水 酸化カ リ ウム緩衝液 （ΡΙΓ7. 0 ) に対し、 1 2時間、 1 回透折 した。
    [0106] ( 4 ) 実施例 1 に従って作製したァフ ィ ゲル 10- Phe- G 1 y - Phe-Gly ゲル 5 をカラムに充塡し （ 1. 0 X 6. 3 cm ) 、 0. 1 M塩化ナ ト リ ウムを舍む 1 O mMへぺス一水酸化力 リ ゥム緩衝 液 （PH7. 0 ) で平衡化した。 このカ ラムに上記 （ 3 ) で得た 試料 （18.1/^) をかけた。 C末端ア ミ ド化酵素を十分にゲル に吸着させるために、 カラムを通過した液を何面もカラムを 通るように循環させた （流速 2 0 /hr) 。 1 2時間後、 循 環を止め、 非吸着物質を 3 5 の平衡化に用いた緩衝液で洗 い出したのち、 0. 4 M塩化ナ ト リ ウム、 2 0 %ァセ トニ ト リ ルを舍む 8 mMへぺス—水酸化カ リ ウム緩衝液 （ pH 7. 0 ) で溶 岀を行った （流速 2 0 /hr) 。 C末端ア ミ ド化酵素活性は 溶出画分 （ 2. 5 ) にのみ認められた。
    [0107] 第 1表に、 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) で行った精製の各工程での 全蛋白質量、 全酵素活性、 比活性、 収率および精製倍率を示 した。 第 1 表 ゥマ ίίΠ '凊からの C关端ア ミ ド化酵素組成物の調製 階 全蛋 ό質 全活性 比 < 収率
    [0108] (mg ) ( U ) ( U ( % )
    [0109] 血 清 7100 199500 28 (100) (1.0)
    [0110] (1 ) ポ リ エチ レ ングリ コール 5101 195072 38 98 1.4 6000沈澱
    [0111] (2) へパ リ ンセ フ ァ ロ ース 328.2 62566 191 32 6.8 CL一 6B
    [0112] (3) 透 折 281.9 67018 238 34 8.5
    [0113] (4) ァ フ ィ ゲル 1 0 3.03 15120 4990 .6 178 -Phe-Gly-Phe-Gly なお、 蛋白質量の測定は、 ロー リ 一の改良法（Bensadounら
    [0114] Anal .Bibchem. , H, 265 , 1976)を用い、 標準曲線は牛血清アル ブ ミ ン （ フ ラ ク シ ョ ン V、 シグマ社製） で作製した。
    [0115] 第 1 表で示したように C末端ア ミ ド化酵素は、 収率 7. 6 %
    [0116] 话
    [0117] で 178倍に精製された。 生>
    [0118] 本精製酵素の活性は、 反応組成物に 5 〜 1 0 %程度のァセ トニ ト リ ルを添加することにより増強された。
    [0119] 例えば、 第 1表 （ 4 ) の酵素試料についてァセ トニ ト リ ル を 1 0 %添加した場合比活性は 9000と約倍に上昇した。
    [0120] また基質を Phe- Gly-Phe-Gly とし、 同一の酵素試料を用い て HPLC法で比活性を算出した場合、 100 Phe-G】y-Phe- Gly , 7. 5 %ァセ トニ ト リ ル （計 200 / ^反応系） の条件でァセ ト二 ト リ ル 0 %の比活性 4000 U Znigに対して 28000 Uノ と 7倍 程度に上昇した。 実施例 3 酵素組成物による式 （ I ) の化合物から式 （ Π ) の化合物の製造
    [0121] 市販ゥマ血清から実施例 2 に従って調製した C末端ァ ミ ド 化酵素標品を用いて、 フユ二ルァラ二ルグリ シルフヱニルァ ラニルダリ シン（Phe-Giy-Phe- Gly) を基質として反応を行つ た。 反応溶液の組成は、 酵素活性の測定方法に記載したもの に準じた。 ただし、 基質濃度は 2 0 全容量は 200 とし-、 酵素標品は 1 0 、 及び 5 0 使用した。 反応生成物は HPLC で検出した。 カ ラムはカプセルパッ ク C8SG、 300 A (資生堂 製） を用いた。 溶出溶媒は、 l mil炭酸ア ンモニゥム (PH 9. 0 ) 及びァセ トニ ト リ ルを使用し、' -ァセ トニ ト リ ルを 0 %から 4 0 %まで 3 0分で増加させる直線濃度勾配をかけた。 ぺプ チ ドば 214nmの吸収で検出した。 結果を第 2図に示した。 ① は 1 0 、 ②ば 5 0 の酵素試料を用いて各々 δ時間反応さ せたときのもので、 11.2分のピークが未反応の Phe-Gly-Phe- Gly 、 15.2分のピークが反応生成物のフユ二ルァラニルダリ シルフェニルァラニンア ミ ド（Phe- Gly-Phe- NH2) である。 生 成物への変換率は、 各々のピーク面積の比から計算して、 ① は 3 0 %程度だが②ではほぼ 100%であった。 また、 ②にお いて、 生成物以外のピークは 1分前後に検出される溶媒由来 のピークを除く と、 面積比で全体の 3 %以下であつた。
    [0122] 実施例 4および 5、 比較例 1〜 5 種々の血清による式 （ I ) の化合物から式 （ E ) の化合物の製造
    [0123] ゥマ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥサギ、 ヒ ト、 ニヮ ト リ およびラ ッ ト の血清中の C末端ア ミ ド化酵素活性を、 式 （ I ) の化合物 (基質） と して D—チコ シル一 L —ノ、'リ ル一グリ シ ン（D- Tyr -Va卜 Gly) (シグマ社製） を用いて測定し、 比較を行った。 市 販の血清を用いたのはゥマ（GIBC0社製） 、 ブタ （Flow し ab社 製） 、 ゥ シ（M. A. Bioproducts社製） 、 ニヮ ト リ （IMow Lab社 製） の 4種であり、 ゥサギ、 ヒ ト、 ラ ッ トの血清は血液から 調製した。 すなわち、 各々 にっき 1 採血し、 4 てでー晚放 置したあと 3000 X g、 1 5 分遠心分離したあとの上清を血清 試料と した。
    [0124] 式 （ Π ) の化合物 （ア ミ ド化反応生成物） を検出しやすい こ とから、 基質中のチ口 シン残基を 1 25 1 ラベルした。 0. 2 Mリ ン酸緩衝液 （pH 7. 2 ) 中で、 2. 0 の D-Tyr- Va卜 Gly 、 2 mCi 放射性ョ ゥ素（125 I ) を混合し、 そこに 1 個のョー ド ビーズ（Iodo bead) (Pirce Chemical社製） を加え、 5 分間反 応させ、 1 0 Wのメ ルカプ ト エタノ ールを添加し、 反応を停 止した。
    [0125] ( 1 25 I 〕 -D- Tyr-Val-Glyは、 HPLC (島津製作所製 LC - 6 - A) を用いて回収した。 カ ラムは㈱資生堂製カプセルパ ッ ク C18SG 120 A 10 を用いた。 溶出は、 水とァセ ト ニ ト リ ルの濃度勾 配によりおこなった。 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸 （ T F A ) 水 溶液 100 %から経時的に、 0.09 % T F Aを舍むァセ ト ニ ト リ. ルを徐々 に混合し、 9 0 分後にァセ トニ ト リ ル 4 0 %となる よ う に直線濃度勾配をかけ溶出した。 約 2 0 %程度のァセ ト 二 ト リ ル濃度で 〔 ' 25 I 〕 Tyr a卜 G lyが放射能のピーク と して検出できた。 このピークを分取し、 凍結乾燥後ア ミ ド 化反応に用いた。 ァ ミ ド化反応溶液の調製は、 前述の薛素活性測定方法に従 い、 次のようにおこなった。 5 0 mMへぺス一水酸化カ リ ウム 緩衝液 （pH 0 ) 、 1 0 ^硫酸銅、 1. 5 mM L —ァスコルビン 酸、 4 ; ^カタ ラーゼ （シグマ社製） 、 2 ^1 D-Tyr-Val-Gly. 20000cpmの 〔 125 I 〕 - D-Tyr- Va卜 Gly並びに各種血清 1 0 ≠ を混合し、 水で全量 8 0 とした。 反応液を 3 7 恒温水檀 中で、 振盪しながら 2時間または 5時間反応させた。 2 πιΜリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ΡΗ 5. 0 ) を 1 添加し反応を停止し た。 反応生成物と基質は、 S Ρ —セフアデッ クス（Sephadex) C -50 (フ ア ルマシア社製） イオ ン交換カ ラムク ロマ トグラ フ ィ 一により分離した。 べッ ト体積 2 のィ ォン交換ゲルに 反応液を通し、 2 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 1 0 ^で未反応 基質を洗い流し （溶液 A) 、 反応生成物のみをゲルに吸着 せた。 次に 0. 5 M塩化ナ ト リ ウムを舍む 5 0 1 ^リ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （PH 5. 0 ) 2. 5 を用い、 反応生成物を溶出した (溶液 B ) 。 溶液 A並びに溶液 Bをそれぞれ凍結乾燥し、 上 逑の HPLC条件により放射能ピークを検出したところ、 シグマ 試薬 D—チロ シルー L—バリ ンア ミ ド（D-Tyr- Va NH2) を上 記方法により 125 I ラベルして得た 〔 125 I 〕 - D-Tyr- Va卜 NHZ のピーク と溶液 Bのピークが、 また、 〔 125 I 〕 -D-Tyr - Val-Glyのピーク と溶液 Aのピークがー致したことから、 基 質と反応物の分難が十分に行われ、 また、 ア ミ ド化反応が正 確に行われていることが確認された。 溶液 Aと溶液 Bの放射 活性を r 一カウ ンタ一により測定し、 基質変換率を前述の式 により求めた。 血清中の蛋白質量は、 ロー リ 一の改良法（Bensadounら、 Anal . Biochem. ,70,265 (1976)) に従って測定した。 このとき 標準曲線は牛血清アルブ ミ ン （シグマ社製） を用いて作製し た。 '
    [0126] 測定した蛋白量を用いて、 蛋白質 1 あたり 1 時間で変換 できる基質量を比活性と して示した。 各種血清の測定結果を 第 2表にま とめた。
    [0127] 第 2表 各種血 jtのア ミ ド化 素活性
    [0128] すべての血清でア ミ ド化酵素活性は見出されたが、 比較例 1 〜 5 では 5時間反応後でも基質変換率は 5 %程度と低いもの であったのに対して、 実施例 4及び 5 のゥマ、 ブタでは変換 率が 5 0 %を越えていた。 また、 比活性を見ても、 比較例に 対して実施例は 4〜 1 0倍程度高かった。 このように、 ゥマ 及びブタ血清、 それ自体も工業的に十分使用でき る C末端ァ ミ ド化酵素活性を示した。
    [0129] 実施例 6 , 了 . tト:較例 6 〜 8
    [0130] 基質として L 一ノ リ ル一グリ シル一 L — } リ ノレー Lーァラ 二ルー L 一プロ リルーグリ シ ン（Val - G 1 y - Va 1 - A 1 a - Pro - G 1
    [0131] (シグマ社製） を用い、 ア ミ ド化反応をおこなった。 血清は- ゥマ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥサギの血液から実施例 4 , 5 と同様に して調製した。 また、 ア ミ ド化酵素液として副腎皮質剌激ホ ルモ ン（ACTH)分泌マウ ス培養細胞 At T - 20抽出液も、 比較 してみた merican T e Cu 1 tur e Co 11 ec tion (ATCC)の株刀 タ グ I ( i 5版 1982) に記載の培養方法により A t T -20 細胞を 250¾£フ ラ スコ培養し π·ンフ レ ン トにな つ た細胞より .
    [0132] Mainsらの方法（Mainsら、 Endocrinology , 114 , 1522, 1984) に従って抽出液を得た。
    [0133] ァ ミ ド化酵素反応は、 実施例 4および 5、 比較例 1 〜 5 に 記載した濃度の混合液でおこなった。 ただし、 基質濃度は 2 5 rf4とし、 全容量は 0. 5 と し、 ア ミ ド化酵素溶液は 300 ≠用いた。 反応物は HPLCにて、 検出した。 溶岀溶媒は、 1 炭酸ア ンモニゥム （ pH 9. 0 ) 及びァセ ト ニ ト リ ルを用い、 ァ セ トニ ト リ ルを 0 %から 6 0 %まで 4 0分で増加させる直線 濃度勾配をかけた。 ポリ ぺプチ ドは 214nmの吸収で検出した, 未反応の Va卜 Gly- Val- Ala-Pro-Gly は保持時間 9. 7分であつ た。 ァ ミ ド化した反応生成物は pH 9条件で C末端の電荷がな く なり、 より疎水性となるため保持時間が長く なり、 13.5分 に検&された。 反応液をこ の条俘て溶出し、 7 分のピーク 面稷 （ C ) 及び 13.5分のピーク面積 （ D ) より基質変換率 ¾ び回収率を求めた。
    [0134] D
    [0135] 基質変換率 （％) X 100
    [0136] C + D
    [0137] C D
    [0138] 回収率 （％ ) = - X 100 未反応溶液の 9. 7分ピー ク面積
    [0139] 結果を第 3表にまとめた。 反応は 5時間の結果を示した 第 3 Val-GlY.-Val-Ala- Pro-Gl のア ミ ド化
    [0140] 基質が Va卜 Gし V- Val -Ala-Pro- Gly であっても、 ゥマ血清及 びブタ血清は、 他の酵素溶液に比較して高い基質変換率並び に回収率を示していた。 A t T — 20抽出液では、 ポ リ べプチ ドがほとんど回収できなかった。 たぶん、 内在性のプロテア ーゼにより分解されたものと思われる。
    [0141] 実施例 8 〜 1 1 、 比較例 9 〜 1 2
    [0142] 基質として、 グリ シル一 L —フヱニルァ ラ二ルーグリ シ ン (GI v-Phe-Gl ) (国産化学製） 、 L - 口 イ シルーグリ ノ ル ― 'グ リ ン ン （Leu- Gly-Gly) (国産化学製） を用い、 ァ ミ ド化反応を おこなった。 比較例と して、 グ リ ノ ル - グリ シ ル - L ― Π! ィ シ ン（Gly_Gly- Leu) (国産化学製） 並びに Lーチロ シル— L — チコ シル一 Lーチロシ ン（Tyr- Tyr- Tyr) (国産化学製） を基質 とした例を示した。
    [0143] ゥマ及びブタ血清は実施例 4および 5で用いたものを用い ，
    [0144] ァ ミ ド化酵素反応条件並びに生成ボリ ぺプチ ドの検出条拌 ば実施例 6および 7に示した条件に準じておこなつた。 HPLC により検出されたピークより得られたア ミ ド化反応効率を第 4表にまとめた。 反応は、 3 0 で、 1 8時間の結果を示した, 第 4表 _ゥマ及びブタ血清によるペプチ ドのア ミ ド化
    [0145] ゥマ血清、 ブタ血清とも Gly - Phe- Gly: し e u - G 1 y - G i yの C太 端を好適にア ミ ド化した。 これに対して Gly-Gly- Leu， Tyr- Tyr- Tyr はア ミ ド化できなかった。 〇末¾グ リ シ ンに特異的 な反応である こ とを示していた。
    [0146] 生成物であるア ミ ド化ペプチ ドは、 HPLCよ り分取する こ と によ り容易に精製できた。 分取溶液に窒素を吹き込むこ とで ァセ ト ニ ト リ ルを蒸発させ、 さ らに凍結乾燥する こ とで、 炭 酸ア ンモ ニゥムは昇華し、 生成物のダリ シル— L ー フヱ ニル ァ ラニンア ミ ド、 及び L — 口 イ シルー グリ シ ンア ミ ドの純品 を得る こ とができた。
    [0147] 実施例 1 2 および 1 3
    [0148] ヒ ト カ ルシ トニングリ シン付 3 加体のァ ミ ド化をおこなった, 特願昭 62- 60171 ( 6 2年 3 月 1 7 日出願の新規遺伝子、 その 発現プラ ス ミ ド D N A及び形質転換微生物、 出願人 株式会 社 資生堂） に記載した方法によ り、 ヒ ト カ ルシ ト ニ ンの C 末端の L 一プロ リ ン残基にグリ シ ンをべプチ ド結合したヒ ト カルシ ト ニ ン前駆体を作製し、 分離精製した。
    [0149] ゥマ血清並びにブタ血清の部分精製は以下のよ う に して行 つた。 血清 2 を ミ リ ポアフ ィ ルタ一 30 , 000分画 （日本ミ リ ボア リ ミ テ ッ ド社製） で濾過し、 ァ ミ ド化酵素タ ンパクを舍 む分子量 30, 000以上の画分を 1 に濃縮した。 これを 1 m の ト リ ス一塩酸パッ フ ァ一PH 7. 0 で洗浄し、 これを部分精製品 と して使用 した。 この操作によ り ゥマ血清中のア ミ ド化酵素 は収率 8 2 %で比活性が 2 8 から 6 2 (pmol/hr/ mg ) に上 昇した。 ブタ血清に関しても収率 7 8 %で比活性は 2 1 から 4 5 ( p m 01 h r / mg ) に丄.异した。
    [0150] ァ ミ ド化反応条件は実施例 6 および 7 に示した条件に準じ、 反応容量は 】 と した。 基踅てある ヒ ト カ ルシ 卜 二 ン グ リ シ ン付加 は 1 0 用いた。 血清精製液は 500 W用いた。 H P L C での生成物の分離結果を第 5表に示した。
    [0151] 第— 5直 ヒ ト カ ルシ ト ニ ンの生直 血清精 基質保 生産物保 回収率 "^： 亦 ' 貝 55^
    [0152] 1 j f 製画分 持時間 持時間
    [0153] ί (分） (分 ) ( % ) 1) ！
    [0154] ！ 実施例 12 ゥマ 67 61 ；
    [0155] 18. 8 23. 1
    [0156] ！ 実施例 13 ブタ 74
    [0157] 3
    [0158] ア ミノ酸残基が 3 3であるヒ oo ト カルシ ト 二 ングリ シ ン付加 体を基質としても好適にァ ミ ド化反応をおこなう ことができ た。 一 · ·
    [0159] 生産したヒ ト カルシ ト ニ ンは実施例 8 〜 1 1 に示した方法 で回収し凍結乾燥した。 得られたヒ ト カルシ ト ニ ン粉末は医 薬品として好適に使用できる。
    [0160] 〔産業上の利用可能性〕
    [0161] 本発明の醇素組成物は、 式 （ I ) で示される C末端グリ シ ン付加体から式 （ Ε ) の C末端ァ ミ ド化物の製造、 および酵 素活性試薬としての利用可能性があり、 また本発明の調製方 法 、 前記酵素組成物の効率のよ 、調製方法として利用可能 であり、 さ らにまた、 前記酵素組成物あるいはゥマまたブタ の血清もし く は血漿は、 式 （ II ) の C末端ァ ミ ド化物の製造 方法に利 可能である。
    权利要求:
    Claims
    1. 次式
    ( Η )
    i
    X - N - A— CONHCHzCOOH ( I )
    (上式中、 Aは、 天然の or—ア ミノ酸に由来する α—ァ ミ ノ 基もし く はィ ミ ノ基およ一 α一一青び or—カルボキ シル基以外の残基を 表しており、 Xは、 水素原子またはカルボ二ル基を介して N 原子と結合するア ミ ノ酸誘導体のの残基を表す） で示される C 末端グリ シン付加体に作用して、 次 E 式
    囲
    ( H )
    X - N - A - C0NH 2 ( Π )
    (上式中、 Αおよび Xは、 前記の意味を表す） で示される C 末端ア ミ ド化物とグリ オキ シル酸の生成反応に関与し、 かつ 該反応に実質的に悪影響を及ぼさない純度を有する血清また は血漿由来の C末端ア ミ ド化酵素組成物。
    2. 前記作用を示し、 さ らに
    ( i ) 至適 PHが約 6. 0 で、 かつ安定 PHが 5 〜 9 にあり、 ( ii ) 作用適温が約 25〜 40ての範囲にあり、 .
    ( iii ) 金属イ オ ンおよび L —ァスコルビン酸を補因子と し、 ( iv ) ゲル濾過による分子量決定法により約 50 , 000およびノ または約 100, 000の分子量を有し、
    ( V ) 等電点ク ロマ トグラ フ ィ 一によ り pH 4. 5 および /また は 6. 7付近に等電点を有し、
    ならびに ( vi ) カタラーゼの添加によ.り前記作用が活性化される こ と を特徴とする請求項 1記載の C末端ァ ミ ド化酵素組成物。
    3. ゲル濾過による分子量決定法により約 50 , 000の分子量 を有する請求項 2記載の C末端アミ ド化酵素組成物。
    4. ゲル濾過による分子量決定法により約 100 , 000の分子 量を有する請求項 2記載の C末端ァ ミ ド化酵素組成物。
    5. 血清またば血漦を前記式 （ I ) で示される C末端グリ シ ン付加体をリガン ドとする基質親和性ク 口マ トグラフ ィ ー で処理することを特徴とする請求項 1記載の C末端ァ ミ ド化 酵素組成物の調製方法。
    6. 前記式 （ I ) で示される C末端グリ シン付加体を、 請 求項 1記載の酵素組成物、 ゥマまたはブタの血清または血漿 から選ばれるいずれかで処理することを特徴とする前記式
    ( I ) で示される C末端ア ミ ド化物の製造方法。
    7. 前記式 （ I ) で示される C末端ダリ シ ン付加体を、 請 求項 1 または 2記載の酵素組成物で処理するこ とを特徴とす る請求項 6記載の方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    CA1338415C|1996-06-25|
    EP0447547B1|1994-07-27|
    AU3681689A|1990-01-05|
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    DE68917154T2|1994-12-22|
    EP0447547A1|1991-09-25|
    AU637765B2|1993-06-10|
    KR920700283A|1992-02-19|
    US5354675A|1994-10-11|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-12-14| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU JP KR US |
    1989-12-14| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): BE CH DE FR GB IT NL SE |
    1990-01-26| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989906194 Country of ref document: EP |
    1991-09-25| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989906194 Country of ref document: EP |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP13018788||1988-05-30||
    JP63/130187||1988-05-30||
    JP1/99960||1989-04-21||
    JP9996089||1989-04-21||EP89906194A| EP0447547B1|1988-05-30|1989-05-25|C-terminus amidation enzyme composition, process for its preparation and its use|
    DE1989617154| DE68917154T2|1988-05-30|1989-05-25|C-terminus-amidierungsenzym-zusammensetzung, verfahren zur herstellung und verwendung.|
    KR1019900700210A| KR920700283A|1988-05-30|1989-05-25|C-말단 아미드화 효소 조성물, 제조방법 및 이의 사용방법|
    US07/459,829| US5354675A|1988-05-30|1989-05-25|C-terminal amidating enzyme composition, process for preparing, and use of the same|
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